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聚合酶链反应反应体系编辑聚合酶链反应PCR操作范例PCR基本原理示意图(如右图):在一个典型的PCR反应体系中需加入:适宜的缓冲液、微量的聚合酶链反应仪器模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2和两个合成的DNA引物
1个回答
标准的PCR反应体系如下。 10 X扩增缓冲液10 4种dNTP混合物各200 ^mol/L 引物 各10〜lOOpmol 模板DNA 0.1〜2 Tag DNA 聚合酶 2. 5 Mg24" 1. 5 mmol/L 加蒸馏水至 100 mL 注意,“X”为倍,“10X”即为10倍; “dNTP”是...
在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。
变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合
聚合酶链反应四种脱氧三磷酸核苷酸(4×dNTPs)在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性,使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入,高浓度dNTPs易产生错误掺入,而浓度太低,势必降低反应物的产量
由于DNA模板的不同和引物不同,以及其它条件的差异,多聚酶的用量亦有差异,酶量过多会导致非特异产物的增加
2.Tris-HCl缓冲液在PCR中使用10~50mmol/L的Tris–HCl缓冲液,很少使用其他类型的缓冲液
PCR体系中采用Premix技术,预混合液中直接含有rTaq、反应Buffer、dNTP 等,加入模板即可进行反应。
聚合酶链反应石蜡油PCR扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油,减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失
成比例没错
阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)
市购的游离核苷酸冻干粉,溶解后要用NaOH中和,再用紫外分光光度计定量