氯金酸（HauC14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0。8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下： ● 将HauC14先配制成0。
01％水溶液，取100ml加热至沸。 ● 搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。 ● 继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。
全过程约2～3min。 ● 冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。 用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。 表19-1 四种粒径胶体金的制备及特性 胶体金粒径（nm） 1％柠檬酸三钠加入量（ml）* 胶体金特性 呈色 λmax 16 2。
00 橙色 518nm 24。5 1。50 橙红 522nm 41 1。00 红色 525nm 71。5 0。70 紫色 535nm *还原100ml0。01％HauC14所需量 2．注意事项 ● 氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。
● 氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 ● 用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 ● 是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。
最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 ● 胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。
肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。
结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0。02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。
免疫金的特性和制备 。
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氯金酸（HauC14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0。8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下： ● 将HauC14先配制成0。
01％水溶液，取100ml加热至沸。 ● 搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。 ● 继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。
全过程约2～3min。 ● 冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。 用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。 表19-1 四种粒径胶体金的制备及特性 胶体金粒径（nm） 1％柠檬酸三钠加入量（ml）* 胶体金特性 呈色 λmax 16 2。
00 橙色 518nm 24。5 1。50 橙红 522nm 41 1。00 红色 525nm 71。5 0。70 紫色 535nm *还原100ml0。01％HauC14所需量 2．注意事项 ● 氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。
● 氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 ● 用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 ● 是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。
最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 ● 胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。
肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。
结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0。02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。
免疫金的特性和制备 。
（一） 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
（二） 胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。 1．枸橼酸三钠还原法 （1）10nm胶体金粒的制备：取0。01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。
（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0。01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0。1Mol/L K2CO30。5ml，混匀即可。 （3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0。
01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2。5ml、1ml或0。75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。 2．鞣酸—枸橼酸钠还原法 A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。
B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0。7ml，0。1Mol/L K2CO3液0。2ml，混合，加入双馏水至20ml。 将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。
如需要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字调整鞣酸及K2CO3的用量。 表15-1鞣酸—枸橼酸钠还原法试剂配制表 金粒直径 （nm） A液 B液 1％HAuCl4 双馏水 1％枸橼酸三钠 0。1Mol/L K2CO3 1％鞣酸 双馏水 5 1 79 4 0。
20 0。70 15。10 10 1 79 4 0。025 0。10 15。875 15 1 79 4 0。0025 0。01 15。9875 3．制备高质量胶体金的注意事项 （1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。
否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 （2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0。45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。
（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7。2）较好。 （4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。 （5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。 （三） 胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 1．待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0。005Mol/L pH7。0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
2．待标胶体金溶液的准备 以0。1Mol/L K2CO3或0。1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9。0；标记McAb时,调至8。2；标记亲和层析抗体时，调至7。6；标记SPA时，调至5。9～6。2；标记ConA时，调至8。
0；标记亲和素时，调至9～10。 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 3．胶体金与标记蛋白用量之比的确定 （1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。 （2）将标记蛋白（以IgG为例）以0。
005Mol/L pH9。0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。 （3）5min后，在上述各管中加入0。1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。
4．胶体金与蛋白质（IgG）的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0。1Mol/L K2CO3调pH至9。0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。
加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10。 5．胶体金标记蛋白的纯化 （1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。
然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0。02％NaN3），将沉淀重悬为原体积的1／10，4℃保存。如在结合物内加50％甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10％～30％蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。 （2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1／5～1／10。
再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。层析柱为0。8 cm×20cm，加样量为床体积的1／10，以0。02Mol/L PBS液洗脱（内含0。1％BSA，0。
05％NaN3，pH8。2者用IgG标记物），流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。
将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。最终可得到70％～80％的产量。 6．胶体金蛋白结合物的质量鉴定 （1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。
计算100个金颗粒的平均直径。 （2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。用0。02Mol/L pH8。2 PBS液（含1％BSA，0。02％NaN3）将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释，OD520＝0。
25左右。一般应用液的OD520应为0。2～0。4。 （3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。
（四） 胶体金标记技术在免疫学中的应用 胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。
1．液相免疫测定：将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。
2．金标记流式细胞术：胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。
3．胶体金固相免疫测定法 （1）斑点免疫金银染色法（Dot－IGS／IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot－IGS）。
此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（Dot－IGS／IGSS）。 （2）斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno－gold filtration assay,DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。
在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。
胶体金的制备 1．制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸（hauc14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0。8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。
具体操作方法如下： （1）将hauc14先配制成0。01％水溶液，取100ml加热至沸。 （2）搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（na3c6h5o7·2h2o）水溶液。 （3）继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。
全过程约2～3min。 （4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。 用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。 表19-1 四种粒径胶体金的制备及特性 胶体金粒径（nm） 1％柠檬酸三钠加入量（ml）* 胶体金特性 呈色 λmax 16 2。
00 橙色 518nm 24。5 1。50 橙红 522nm 41 1。00 红色 525nm 71。5 0。70 紫色 535nm *还原100ml0。
01％hauc14所需量 2．注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 （5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。
因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。 肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。
在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0。
02％nan3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。 。
金免疫技术 金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在70年代初期由faulk和taylor始创，最初用于免疫电镜技术。迄今为止，金标记仍主要用于免疫组织化学中。在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的简便、快速检验方法。
第一节 免疫胶体金的制备 一、胶体金的特性和制备 （一）胶体金的结构 胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（auc12－），外层离子层h+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。
胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。 （二）胶体金的特性 1．胶体性质胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。
胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。 2．呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。
最小的胶体金（2～5nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（10～20nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。 3．光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λmax）在510～550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λmax偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长，表19-1所列为部分胶体金的λmax。
（三）胶体金的制备 1．制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸（hauc14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0。8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。
具体操作方法如下： （1）将hauc14先配制成0。01％水溶液，取100ml加热至沸。 （2）搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（na3c6h5o7·2h2o）水溶液。 （3）继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。
全过程约2～3min。 （4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。 用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。 表19-1 四种粒径胶体金的制备及特性 胶体金粒径（nm） 1％柠檬酸三钠加入量（ml）* 胶体金特性 呈色 λmax 16 2。
00 橙色 518nm 24。5 1。50 橙红 522nm 41 1。00 红色 525nm 71。5 0。70 紫色 535nm *还原100ml0。
01％hauc14所需量 2．注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 （5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。
因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。 肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。
在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0。
02％nan3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。 二、免疫金的特性和制备 （一）免疫金的特性 胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。
用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。 胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。
因此环境ph和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。 （二）免疫金的制备 1．用0。2mol/lk2co3或0。1mol/lhc1调节胶体金溶液的ph至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。
但通常最适反应ph往往需经多次试验才能确定。 在调节胶体金的ph值时应注意，胶体金会阻塞ph计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0。15的聚乙二醇（peg，20000）稳定胶体金后，再胶体金的ph值。 2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。
由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。 3．加入浓度为0。2％的peg或bsa以饱和游离的胶体金。 4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。
离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。 5．轻吸上清液。
沉淀用含peg或bsa的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。 6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的pbs或tris缓冲液。 多种蛋白质、葡聚糖、peg2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，peg和bsa是最常用的稳定剂。
稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。 。
胶体金是氯金酸在还原剂的作用下,聚合成的具有一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水性胶体溶液.根据实验目的的需要...取0.01%的氯金酸水溶液100ml,加入1%的枸橼酸三钠水溶液3ml,加热煮沸30分钟,冷却止4℃,溶液呈红色
答：2种。链上的H被CL取代。-OH不被取代。详情>>
