本法系用高效液相色谱法(附录Ⅴ Ｄ)测定维生素D(包括维生素D和D,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D0。025μg。 
　　测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。
   
　　无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测 定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定。 
　　第一法 
　　对照品贮备溶液的制备 
　　根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D或D对照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存。
   
　　测定维生素D时，应另取维生素D对照品25mg，同法制成维生素D对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。 
　　内标溶液的制备 
　　称取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 
　　色谱条件与系统适用性试验 
　　用硅胶为填充剂，正己烷－正戊醇（997∶3）为流动相，检测波长为254nm。
  量取维生素D对照品贮备溶液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出迅速冷却，加正己烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254和365nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5～6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D、反式维生素D、维生素D和速甾醇D；取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D的峰值，先后进样5次,相对标准偏差应不大于2。
  0％；前维生素D(与维生素D的比保留时间约为0。5)与反式维生素D(与维生素D的比保留时间约为 0。6)以及维生素D与速甾醇D(与维生素D的比保留时间约为1。1)的峰分离度均应大于1。0。 
　　校正因子测定 
　　精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素D的校正因子f。
   
　　另精密量取对照品贮备溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6－二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1．5小时，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液5ml，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算前维生素D折算成维生素D的校正因子f。
   
　　f＝(A·m－fmA)／A·m 
　　式中 
　　A为内标的峰值； 
　　m为加入对照品的量； 
　　f为维生素D的校正因子； 
　　m为加入内标物质的量； 
　　A为维生素D的峰值； 
　　A为前维生素D的峰值。 
　　含量测定 。